从青霉菌培养物中初步分离、纯化抗氧化组份, 并对各个抗氧化组份的总抗氧化能力、DPPH· 自由基、羟自由基和超氧阴离子清除能力进行测定。青霉菌培养液分别用石油醚、乙酸乙酯萃取后, 水相经HP20大孔树脂柱层析和葡聚糖凝胶G-75柱层析, 结果表明, 其有效组分对DPPH· , · OH和O2-· 三种自由基有较好的清除能力, 且清除作用与浓度成正相关性。

　本课题组在进行香蕉果汁加工实验时发现, 绝大多数瓶装果汁在放置超过半年以后, 即使是加入了抗氧化剂(维生素C、柠檬酸等)仍然会发生非酶促变色, 原有的浅橙黄色变为棕褐色;然而却有少数杀菌不严、长有某种霉菌样生长物的果汁, 能长期保持原有颜色。提示这种霉菌样生长物能分泌某种抗氧化物质, 具有抗非酶促变色作用和抗氧化能力。笔者从霉菌样生长物中分离得到22个青霉菌株, 通过对青霉菌株的分离和筛选, 获得了1株抗氧化活性较高的青霉菌菌株No.18。本实验室从青霉菌培养液中初步分离、纯化出抗氧化组分, 并对各个抗氧化组分的抗氧化活性及清除自由基的能力进行初步研究。这一研究有助于为通过真菌发酵开发天然抗氧化活性物质提供新的和优良的出发菌株。

1　材料和方法

1.1　材料与仪器

1.1.1　菌株来源

来自香蕉果汁霉菌培养物中分离获得的青霉菌株, 共获得22 株。菌种保藏采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。利用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定菌株发酵液粗提物的总抗氧化活性, 进行菌种筛选。菌株No.18 表现出最高的总抗氧化活性,故选定其作为供试菌种。

1.1.2　培养基

沙氏培养基, 察氏培养基, 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

1.1.3　试剂

DPPH(Sigma公司);总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(南京建成生物工程研究所);沙保罗氏琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司);葡聚糖凝胶G-75(北京拜尔迪生物公司);大孔树脂HP20(日本三菱公司);其他试剂均为国产分析纯试剂。

2　讨论

微生物是产生天然活性化合物的天然宝库。据估计, 现在已知的真菌不到总数的5% , 表明还有成千上万的微生物种类有待进一步开发 。而且不同的生态环境下微生物的种类和数量不同, 进而也会产生不同的次级代谢物。青霉菌是一种潜在的活性物质的产生菌之一, 已报道的活性化合物就有青霉素类抗生素, 生物碱类、蒽醌类、芳香类、醇类及酯酸类等次级代谢物, 还有Vermistatin类、FuniconelikeCompound,菌素类像布雷菲得菌素等等 , 但对其产生的抗氧化活性物质的研究报道很少。抗氧化剂是一类重要的生物活性物质, 它可以清除人体代谢过程中产生的自由基, 具有延缓机体衰老的功效。抗氧化剂近年来在国内外发展很快, 用途也越来越广, 不但可以添加在动植物油及人类食品中, 同时越来越多的抗氧化剂也用于化妆品行业。经科学家研究发现, 人工合成的抗氧化剂BHA(丁基羟基茴香醚)和BHT(二丁基羟基甲苯)能够抑制人体的呼吸酶活性, 使用过量可致畸、致癌。人们把目光逐渐转向天然抗氧化剂, 从各种动植物中提取, 如茶叶中的茶多酚、大豆中的大豆异黄酮、骨骼肌的肌肽等。具有抗氧化性质的天然物质结构类型主要有:黄酮、单宁、维生素类、醌、含氮化合物、植酸、香豆素、萜类和烯酸等。本实验成功地分离鉴定出分泌强抗氧化物质的青霉菌株, 经初步研究, 青霉菌培养液水相提取物对DPPH· 、· OH和O2-· 3种自由基均有较强清除能力, 并且随着提取物浓度的升高, 其清除自由基能力逐渐增加, 表明提取物的用量对清除自由基的能力存在量效关系, 是一种有效的自由基清除剂。

  本实验中以甲醇相借助制备薄板层析后进行GC-MS分析, 均检测出邻苯二甲酸类物质以及甲瓦龙酸内酯(3, 5-二羟基-3-甲基戊酸内酯)。甲瓦龙酸内酯可能被霉菌水解成甲瓦龙酸, 而甲瓦龙酸是合成重要抗氧化物质萜类化合物的重要前提。目前有报道甲瓦龙酸内酯已被佳丽宝公司运用于化妆品系列,以达到肌肤美白的效果, 其机制有待探索, 而邻苯二甲酸类物质尚未有关抗氧化能力方面的报道。在相同浓度下, 样品b比样品a清除DPPH· 、· OH和O2-· 3种自由基的能力都要强, 但样品b、样品a与Vc比较还存在较大差距, 有待进一步纯化并进而鉴定其有效成分的分子结构。

  目前对抗氧化物质的研究所取得的进展, 让我们看到开发天然抗氧化剂广阔的应用前景, 以天然抗氧化剂取代化学合成的抗氧化剂是今后工业发展的趋势, 开发实用、高效、成本低廉的天然抗氧化剂仍是研究的重点。当前对青霉菌培养液提取物的抗氧化物质研究还有所欠缺, 本实验结果为下一步确定青霉菌来源的抗氧化物质的结构奠定了基础, 值得进一步研究。