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超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究

2015-06-15 21:25:42
[导读]采用超声波破碎法对嗜酸乳杆菌A 和B 产生的β - 半乳糖苷酶进行提取,并以邻硝基苯- β -D- 半乳糖苷(ONPG)为底物测定了β - 半乳糖苷酶的活力。

  嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是宿主(人和动物)肠道中的重要微生物,其能顺利通过肠胃环境而定殖肠内,当达到一定数量时,能够改善、调节宿主肠内微生物群的平衡,促进宿主的健康,即所谓的健康促进效果(Probiotic effects)。牛乳中含有4.6%左右的乳糖,为了在肠道中有效地被吸收,乳糖需要在乳糖酶的作用下水解成葡萄糖和半乳糖。几乎所有的婴儿肠道内的乳糖酶活性都很高,然而,大多数人在3 ~5岁以后乳糖酶活性开始降低,大约降低了9 0 % ~9 5 % 。目前认为,肠道内乳糖酶活性的降低是由一个隐性基因控制的,是人类生理活动的一种正常模式。实验证实,即便是通过外界刺激(如连续促进乳糖吸收)也无法提高乳糖酶的活性。

  乳糖酶活性的这种降低过程被称为乳糖非持久性(Lactase nonpersistence, LNP)现象。由于成年人的肠道内缺乏乳糖酶,致使乳糖在大肠中积累,成为肠道微生物的发酵基质,结果引起腹泻、腹涨,腹部疼痛和肠胃气胀等不适症状,这种现象称为乳糖不忍耐症(Lactose Intolerance)。世界上有相当比例的人,特别是亚洲人患有乳糖不忍耐症,因此乳糖不忍耐症愈来愈多的受到人们的关注。嗜酸乳杆菌具有产生一定β -半乳糖苷酶的能力,但由于β - 半乳糖苷酶属于胞内酶,对其检测需要进行细胞破壁,细胞破壁的方法很多,如物理研磨法、化学溶解法等,但其效果不是十分理想,活力不能精确测定,故本实验采用超声波破碎法对嗜酸乳杆菌细胞进行破壁,试图有效检测β -半乳糖苷酶的活性,从而为嗜酸乳杆菌作为功能菌种和益生因子应用于乳品中来有效缓解乳糖不忍耐症提供理论依据。材料与方法、材料、菌种Lactobacillus acidophilus Ind-1(嗜酸乳杆菌A,简称La-A)与Lactobacillus acidophilus Lakcid(嗜酸乳杆菌B,简称La-B)来源于波兰罗兹技术大学食品化学与生物工程学院发酵工程与工业微生物系。由河南科技学院食品研究所分离、纯化、培养。其最适生长温度为37℃。MRS培养基 试剂邻硝基苯-β-D- 半乳糖苷(ONPG)、MgSO4·7H2O、MnCl 2 等。主要仪器和设备UV1100 紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;JY92-2D 超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;RC-5C Sorvall instruments Du Pont CompanyClinical and instrument Systems Division Newtown CT等。

  方法菌种活化将A,B 两株菌种(冷冻干燥针剂)于无菌条件下分别接种于MRS 培养基中,之后以10% 的量再次接种于MRS培养基中,于37℃恒温培养18h。反复活化3~5 次制得种子液。 菌种细胞的分离取培养18h的菌液10ml用磷酸盐缓冲液(pH值为6.4,每1 L 磷酸盐缓冲液需N a H 2P O 4·2 H 2O 0 . 5 7 3 4 g ,Na2HPO4·12H2O 0.4647g 以下缓冲液均同此)25ml 配置成0.4mol/ml的悬液,于5000r/min,10℃,低温离心20min,离心3 次。弃上清液待用。 细胞破碎及酶液的提取将离心好的菌种用缓冲液配置成0.4ml/ml的悬液(方法同上) ,在细胞破碎机中进行超声波破碎,工作条件按单因素和正交试验表进行,制得细胞破壁后酶液样品。工作间隙用冰水浴冷却。




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