苦菜氨基酸的提取

准确地称取１．０ｇ苦菜粉末（过１２０目筛）于１００ｍＬ锥形瓶中，加入一定质量分数的乙醇溶液，摇匀，用保鲜膜将瓶口密封，在一定的超声波功率下超声提取一定时间后冷却抽滤，超声提取２次，合并两次滤液．将滤液转至梨形分液漏斗中加入石油醚（Ｖ（石油醚）∶Ｖ（提取液）＝１∶２０）纯化脱除脂溶性杂质，再转移到１００ｍＬ容量瓶中定容，摇匀，作为供试品溶液备用．

１．２．２　苦菜氨基酸的测定

标准液的配制：将Ｌ－ 酪氨酸标准品于１００℃下干燥至恒重，准确称取酪氨酸０．０１０　０ｇ，加０．０２ｍｏｌ·Ｌ－１的ＮａＯＨ 溶液１０ｍＬ，溶解完全后转移到１００ｍＬ容量瓶中，用蒸馏水定容后摇匀，得０．１００ｍｇ·ｍＬ－１的Ｌ－ 酪氨酸标准溶液，备用．

标准曲线的绘制：用吸量管准确吸取０，１．００，２．００，３．００，４．００，５．００，６．００ｍＬ标准液于２５ｍＬ容量瓶中制成一系列标准溶液．分别加２％茚三酮溶液１．００ｍＬ和ｐＨ＝６．８的磷酸盐缓冲溶液２．００ｍＬ，摇匀，瓶口用保鲜膜封住于水浴锅中加热１５ｍｉｎ，取出，冷却至室温，定容．利用７２２Ｓ可见分光光度计在最大波长（λｍａｘ＝５６６ｎｍ）处测定吸光度，以Ｌ－ 酪氨酸质量浓度为横坐标（ｘ）、吸光度为纵坐标（ｙ）绘制标准曲线，见图１．拟合的线性回归方程为：ｙ＝０．０２１　４ｘ－０．０００　５，Ｒ２＝０．

９９９　８．图１　Ｌ－ 酪氨酸标准曲线Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　Ｌ－Ｔｙｒｏｓｉｎｅ

１．２．３　样品中氨基酸提取率的测定

从供试品溶液中准确量取５．００ｍＬ的苦菜提取液于２５ｍＬ容量瓶中，按１．２．２中方法显色后，取出，冷却，用乙醇定容．用７２２Ｓ可见分光光度计在λｍａｘ＝５６６ｎｍ处测定其吸光度，代入回归方程计算总氨基酸含量，根据下式计算出超声波提取液中氨基酸的提取率ｗ．

ｗ ＝ρ×１００ｍＬ×２５ｍＬ５ｍＬ×１０６×ｍ ×１００％式中，ｗ 为样品中总氨基酸的含量（以Ｌ－ 酪氨酸计），％；ρ为样品中总氨基酸的质量浓度，μｇ·ｍＬ－１；ｍ 为样品的质量，ｇ．

２　结果与分析

２．１　苦菜提取物的组成表征

标准品与样品的预处理：按文献方法对苦菜提取样进行样品的处理，备用．异硫氰酸苯酯柱前衍生化反应：精确量取苦菜样品溶液１ｍＬ，分别置于５ｍＬ的离心管中，真空干燥；加入１ｍＬ的再干燥液（Ｖ（乙醇）∶Ｖ（水）∶Ｖ（三乙胺）＝２∶２∶１），再加入衍生剂溶液２ｍＬ（Ｖ（异硫氰酸苯酯）∶Ｖ （甲醇）∶Ｖ （三乙胺）∶Ｖ（水）＝１∶７∶１∶１），超声处理２０ｍｉｎ后放置２０ｍｉｎ，再真空干燥．干燥后的样品加１０ｍＬ样品稀释液，超声溶解，用０．４５μｍ滤膜过滤，备用（密闭４℃）．色谱条件：色谱柱Ｅｃｌｉｐｓｅ　ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６ｍｍ

×１５０ｍｍ，５μｍ）；流动相Ａ 为０．１ｍｏｌ·Ｌ－１乙酸钠溶液（冰醋酸调节ｐＨ＝６．５０）－乙腈（Ｖ（乙酸钠溶液）∶Ｖ（乙腈）＝９３∶７）；流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长２５４ｎｍ，柱温３６ ℃，进样量１０μＬ．梯度洗脱：按照表１中流动相Ａ、流动相Ｂ体积分数进行对照品和样品溶液的洗脱，总时间为２１ｍｉｎ

通过高效液相对苦菜中所含氨基酸的组分进行定性分析，图２中的出峰保留时间与文献［１８］中氨基酸标准品的出峰时间基本保持一致，根据

不同氨基酸的极性各不相同判定所得苦菜提取物中的１７种氨基酸，结果如表２所示．

２．２　单因素实验

２．２．１　超声功率对苦菜氨基酸提取率的影响

固定料液比为１ｇ料４０ｍＬ乙醇（下同），乙醇质量分数为６０％，超声提取２次，每次３０ｍｉｎ，超声提取温度６０℃，考察超声功率对苦菜氨基酸提取率的影响，结果见图３．在实验过程中所使用的超声仪器，其功率可调范围（４０～１００Ｗ）较小．由图３可知，超声功率对苦菜氨基酸的提取率有一定的影响，但并不是功率越大提取率越高，在７０Ｗ 之后提取率呈或高或低波动；超声功率较低时，机械振动不剧烈、对细胞破坏程度小，空化作用不够，不足以令溶质迅速扩散，提取率低；功率过高时，机械振动产生的超声强烈效应可能导致提取液中氨基酸的结构

被破坏．另外，苦菜的细胞壁也可能变形、破裂，而使内含物释放，使氨基酸提取率假性提高．综上只要在一定的功率下保证有较高的提取率即可，实验表明，最佳超声功率为６０Ｗ．

２．２．２　乙醇质量浓度对苦菜氨基酸提取率的影响

固定料液比为１ｇ料４０ｍＬ乙醇、超声提取２次，每次３０ｍｉｎ，超声提取温度６０℃，超声功率为６０Ｗ，考察乙醇质量分数对苦菜氨基酸提取率的影响，结果见图４．由图４可见乙醇质量分数在６０％时，苦菜中氨基酸的提取率最高．由于苦菜中的氨基酸成分有１７种之多［９］，根据相似相溶原理，当质量分数小于和大于６０％时提取率低，可能是因为质量分数偏低时样品中非极性氨基酸溶出量少，反之，质量分数较高则降低极性氨基酸的溶出．此外，当质量分数过高时，会使脂溶性色素随之溶解，造成假性的吸光度增加，即提取率假性提高．

２．２．３　料液比对苦菜氨基酸及提取率的影响

固定乙醇质量分数为６０％，超声提取２次，每次３０ｍｉｎ，超声功率６０Ｗ，超声提取温度６０℃考察料液比对苦菜氨基酸提取率的影响，结果见图５．由图５可知，随着乙醇的增加，苦菜氨基酸的提取率明显增加，增至３０ｍＬ后提取率呈缓和趋势，所以保持一定的料液比是很有必要的．刚开始提取率较低可能是因为溶剂量小时，氨基酸没能完全溶解在溶剂中，随着乙醇体积的增加，提取得越彻底，但综合考虑提取率、经济成本因素以及降低浓缩负担等原因，在实验过程中选择１ｇ料加４０ｍＬ乙醇为最佳的料液比．

２．２．４　超声提取时间对苦菜氨基酸提取率的影响

固定乙醇质量分数为６０％，超声提取２次，料液比为１ｇ料４０ｍＬ乙醇，超声功率６０Ｗ，超声提取温度６０℃，考察超声提取时间对苦菜氨基酸提取率的影响，结果见图６．由图６可知，随着提取时间的增长苦菜氨基酸的提取率先增大后减小，当提取时间为３０ｍｉｎ时达到最大，而后氨基酸的提取量减少；可能的原因是，在加热的条件下，时间越长，乙醇的挥发量越多，乙醇质量浓度下降，同时氨基酸被氧化分解的量也增加，从而造成提取率降低，因此确定３０ｍｉｎ为最佳超声提取时间．图６　超声提取时间对苦菜氨基酸提取率的影响

Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ

２．２．５　超声提取温度对苦菜氨基酸提取率的影响

固定乙醇质量分数为６０％，超声提取２次，每次３０ｍｉｎ，１ｇ料４０ｍＬ乙醇，超声功率６０Ｗ，考察超声提取温度对苦菜氨基酸提取率的影响，结果见图７．图７　超声提取温度对苦菜氨基酸提取率的影响Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｒａｃｔｉｏｎｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ由图７可知，苦菜氨基酸的提取率随提取温度的升高先增大后减少，当提取温度为６０℃时达到最大值；温度升高，扩散系数增大，提取剂的渗透能力也相应地增加，使有效成分浸出速率增大；但当温度继续升高时，提取率反而降低，可能是由于氨基酸化合物在较高温度下会发生氧化分解等反应而遭到破坏；此外，过高的温度会加速乙醇的挥发速度，使溶剂乙醇的浓度迅速降低而影响了氨基酸的溶出．

２．３　正交实验［２０］

在单因素试验的基础上，对苦菜中氨基酸的提取工艺条件进行优化，选用Ｌ９（３４）正交试验表安排试验，选择提取时间（Ａ）、乙醇质量浓度（Ｂ）、料液比（Ｃ）、提取温度（Ｄ）４个因素，每个因素选择３个水平，确立因素水平表３，提取结果见表３．由表４可知，各因素对超声波提取苦菜氨基酸提取率的影响大小依次为：Ｂ＞Ｃ＞Ａ＞Ｄ，即乙醇质量分数＞料液比（１ｇ料加的乙醇量）＞提取时间＞提取温度．确定最佳提取工艺条件为：Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２，即超声提取时间为３０ｍｉｎ，乙醇质量分数为６０％，料液比为１ｇ料４０ｍＬ乙醇，超声提取温度为６０℃．

２．４　最佳工艺验证实验

在Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２工艺条件下进行验证试验，结果见表５．在Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２工艺条件下，三明野生苦菜氨基酸得率的平均值为１．２９％，相比于正交实验中所设计的４号瓶提高了０．１０％，进一步确定了Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ２为三明野生苦菜中氨基酸超声波提取的最佳工艺条件．

３　结　　论

（１）超声波法提取苦菜中氨基酸的最佳提取工艺条件为：乙醇质量分数６０％，超声功率６０Ｗ，料液比为１ｇ料４０ｍＬ 乙醇，提取时间３０ｍｉｎ，提取温度６０ ℃，此时氨基酸的提取率１．２９％．

（２）本文对苦菜提取液进行ＰＩＴＣ柱前衍生反应，使总氨基酸发生解离，利用高效液相色谱法对苦菜中所含的氨基酸进行定性分析，每一种氨

基酸都可正常出峰，１７种氨基酸被检出，其中有７种人体必需氨基酸．

（３）异硫氰酸苯酯柱前衍生－高效液相色谱法与相关文献的测定方法相比，该法不需要对胱氨酸另外处理，分析速度快、时间短，灵敏度、精密

度、分离度高，检出限低，选择性好，通用性强，经济简便．

（４）正交实验超声波提取苦菜中氨基酸影响因素的重要性依次为：乙醇质量浓度＞料液比＞提取时间＞提取温度．