大蒜素亚微乳注射液的制备

称取蛋黄卵磷脂1??0 g, 维生素E 0??2 g, 注射用大豆油3??0 g和注射用中链油3??0 g混合后, 加热并不断搅拌至溶液全部澄清, 加入大蒜素原料

1??5 g使之全部溶解作为油相; 再称取甘油2??5 g溶解于适量注射用水中, 于适宜温度搅拌后加至上述油相混合物中, 形成初乳, 加适量氢氧化钠溶液调节溶液pH 至6??0, 补加注射用水至100 mL, 混匀, 经高压乳匀机精乳化3次, 并以0??22 ??m 微孔滤膜过滤除菌, 最后无菌灌封至2mL安瓿瓶中, 即得大蒜素亚微乳注射液。

2??2?? 大蒜素亚微乳体内外含量测定方法的建立

2??2??1?? 色谱条件?? 色谱柱: C18 ( 4??6 mm ?? 250mm, 5 ??m) ; 流动相: 甲醇??水??甲酸( 87??13??0??1), 检测波长: 220 nm, 柱温: 35 ?? , 流速: 1??0 mL /m in。

2??2??2?? 制剂的含量测定?? 精密量取本品适量(约相当于大蒜素7??5mg), 置100mL量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 超声10m in, 作为供试品溶液;另精密称取大蒜素对照品适量, 加甲醇溶解并稀释制成每毫升中约含75 mg 大蒜素的溶液, 作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20 ??L注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算。经测定, 大蒜素亚微乳中大蒜素的含量为15mg /mL, 样品标示量为100??5% 。在本色谱条件下, 各辅料不影响大蒜素的测定, 专属性良好, 在25??5~ 127??5 ??g /mL浓度范围内线性关系良好, 线性方程为A = 29 626c + 36 251( r = 0??999 7), 精密度、回收率及溶液稳定性均符合要求。

2??3?? 大蒜素亚微乳注射液的质量评价

2??3??1?? 大蒜素亚微乳的外观性状及微观形态?? 本品外观性状为白色乳状液体, 略带黏性, 略有特异性蒜臭味。将大蒜素亚微乳注射液以磷酸盐缓冲液稀释10倍, 滴于铜网上, 1% 磷钨酸染色, 负染30m in, 干燥后用透射电镜(TEM )观察。通过透射电镜观察到制备的大蒜素亚微乳注射液为大小均匀的球形或椭球形粒子, 如图2所示。

2??3??2?? 大蒜素亚微乳的粒径分布?? 取本品1支,精密吸取其中0??1 mL, 用纯化水分别稀释至100倍, 混匀, 作为供试液, 用动态激光散射粒径测定仪测定。测得的大蒜素亚微乳注射液的平均光强径为152??9 nm; 体积径为115??7 nm, 所得制剂粒径较小、分布均匀、分布范围较窄。

2??3??3?? 大蒜素亚微乳注射液的包封率测定?? 采用超滤离心法测包封率, 将超滤离心管(截留相对分子质量8 000~ 10 000)用注射用水洗去甘油, 精密吸取本品250 ??L, 加入超滤离心管中, 离心( 10 000r /m in) 30 m in。取出全部滤出液, 按上述含量测定方法计算游离的大蒜素含量; 同时精密吸取超滤离心前的样品, 计算溶液中大蒜素的总溶质量; 计算大蒜素亚微乳样品的包封率为96??5%。

2??3??4?? 稳定性试验

配伍稳定性试验?? 取大蒜素亚微乳注射液5mL, 按临床用法分别加入到5% 葡萄糖注射液或0??9%氯化钠注射液250 mL中, 分别在第0, 0??5,2, 6小时吸取稀释液, 考察其含量、pH 及平均粒径的变化。测定结果如表1。结果表明, 0??9% 氯化钠注射液对本品的稳定性优于5%的葡萄糖注射液, 葡萄糖注射液配伍6h后有较大乳粒。影响因素试验?? 以大蒜素亚微乳的外观、pH、粒径、含量、有关物质、包封率为指标, 考察其在高温( 60 ?? 2) ?? 、( 40 ?? 2) ?? , 低温4 ~ 8 ?? 、光照条件下, 放置5, 10 d的稳定性, 另外将样品冷冻放置24 h, 再室温放置24 h, 作为一次冻融循环, 于第3次循环完成后取样, 考察各项指标。结果如表2所示。结果表明, 本品在60 ?? 高温条件下放置5 d,含量下降均超过5%, 乳滴平均粒径稍有增大, 所以不再进行10 d的考察; 在低温( 4~ 8 ?? )下, 各项指标均无明显变化。光照条件下部分药物降解,含量下降显著, 包封率随温度和光照强度的增强而降低冻融循环3 次后粒径增幅较大, 有破乳现象, 包封率下降较快。综上所述, 本品在此包装条件下, 宜在遮光, 密封, 阴凉处贮存, 不宜冷冻保存。加速和长期稳定性试验?? 以大蒜素亚微乳的外观、粒径、pH、含量、有关物质为指标, 考察样品加速及长期试验6个月的样品稳定性。加速试验条件为25 ?? 下避光放置6个月, 分别于0, 1, 2, 3,6月取样, 长期试验条件为20 ?? 下避光放置12个月, 分别于0, 3, 6, 9, 12个月取样测定。测定结果如表3。

加速试验结果表明, 本品在模拟上市包装的条件下, 在( 25 ?? 2) ?? 条件下放置6个月, 亚微乳剂外观性状没有破乳、分层等现象, 含量稍有下降, 有

关物质含量略有升高, 乳滴的平均粒径有所增大,但均在限度范围内, 其他各项质量指标均未见明显改变, 说明本品在此包装条件下物理及化学稳定性较好。长期试验结果表明, 在模拟上市包装条件下,经( 20 ?? 2) ?? 、遮光, 密封条件下贮存留样12个月试验考察, 各项指标无明显变化, 说明本品在此包装条件下12个月内物理及化学稳定性较好, 此项实验仍在进行中。

2??3??5?? 大蒜素亚微乳注射液的刺激性考察?? 取家兔8只, 雌雄各半, 平均分成两组, 采用同体左右耳自身对比法进行试验。一组给予大蒜素注射液

(乳剂)的供试品溶液, 另外一组给予大蒜素注射液(市售)的供试品溶液作为对照组, 两组家兔每只分别右耳静脉缓慢滴注供试品溶液1??2 mg /kg(给药容积为5mL /kg) , 左耳静脉注射等容积的灭菌5%葡萄糖注射液, 每日1次, 连续3日; 每日肉眼观察动物一般状况、行为、体征及给药局部反应

(颜色、红斑、水肿、充血程度及范围), 末次给药后48 h, 处死动物, 分别剪取双耳注射处耳静脉及周围组织约5 cm, 肉眼观察有无红肿、水肿、丘斑形成, 并用10%的甲醛固定后, 石蜡切片, HE 染色,显微镜下观察其炎性细胞浸润、血管周围组织出血、血栓形成及坏死等情况, 并判断血管刺激性反应程度。

结果表明, 给药期间动物的一般状况、行为及活动正常。大蒜素注射液(乳剂)连续给药3 d, 肉眼观察家兔耳静脉血管及周围组织, 未见红肿、充

血等异常现象。显微镜观察, 5% 葡萄糖注射液组和大蒜素注射液(乳剂)组血管内皮细胞、血管腔及周围组织在距注射部位1 cm和5 cm 处均未见

异常; 血管周围组织未见炎性细胞浸润及坏死; 管腔内无血栓形成。而大蒜素注射液市售对照组家兔耳静脉血管及周围组织可见红肿、充血现象。

2??3??6?? 大鼠药代动力学试验?? 取健康SD大鼠72只, 雌雄各半, 体重180~ 230 g, 随机分成两组, 分别给予大蒜素亚微乳注射液或大蒜素注射液, 每组再随机分成6组, 每小组采集两个时间点。给药前禁食12 h, 自由饮水, 按30mg /kg的剂量经大鼠尾静脉注射, 第1组于给药后0??2m in, 第2组于给药后0??5、4 m in, 第3组于给药后1, 5 m in, 第4 组于给药后1??5, 6 m in, 第5 组于给药后2, 8 m in, 第6组于给药后3, 10m in经大鼠眼球后静脉丛取静脉血0??4 mL, 置肝素化试管中, 迅速进行全血样品处理。

体内含量测定方法: 色谱条件同制剂含量测定方法, 精密称取大蒜素对照品适量, 加乙腈溶解制成浓度为500 ??g /mL的贮备液, 避光、冷藏保存作为对照品贮备液; 分别精密吸取大蒜素贮备液, 加乙腈依次配制1??25, 2??5, 5, 10, 25, 50 ??g /mL 的标准系列溶液, 避光、冷藏保存作为大蒜素标准系列溶液; 精密称取丙泊酚对照品30??0 mg, 加乙腈溶解制成浓度为3 000 ??g /mL的溶液, 再精密吸取

2??5mL用乙腈定容至50mL, 得溶度为150 ??g /mL的溶液, 避光、冷藏保存作为内标溶液。取全血300 ??L, 迅速加入内标200 ??L 及乙腈200 ??L, 涡

流30秒, 静置1 m in, 于12 000 r /m in 离心5 m in,取上清液20??L 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按

内标法计算, 即得。自制亚微乳注射液与市售大蒜素注射液两组试验相比, 亚微乳的半衰期略有延长, 药时曲线下面积AUC 略大于普通注射液, 表观分布容积略低于注射液, 说明在同样剂量条件下, 大蒜素亚微乳在体内能够维持稍长的循环时间, 使其有更多的机会达到各组织, 更好地浓集于组织细胞中达到治疗效果。其相对生物利用度为122??8%, 结果见表4,图3所示。