摘 要：目的：建立三聚氰胺残留的免疫分析方法。方法：以三聚氰胺结构类似物2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪为原料，分别与6- 氨基己酸和对氨基苯甲酸，各经两步化学反应合成两种具有不同长度间隔臂的半抗原MEA 和MEB，并分别通过碳二亚胺法和混合酸酐法将MEA和MEB 与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联，制备三聚氰胺的免疫原(MEA-BSA)和包被原(MEB-OVA)。结果：经质谱和紫外光谱表征，证明所合成的产物为目标半抗原MEA和MEB，并且与载体蛋白偶联比可达到25.28:1(MEA-BSA)和13.11:1(MEA-OVA)。结论：半抗原MEA和MEB 及人工抗原合成成功。
关键词：三聚氰胺；半抗原；人工抗原
自2 0 0 8 年发生“三鹿奶粉”事件以来，“三聚氰胺”一词已成为家喻户晓、妇孺皆知的化学物质。三聚氰胺并不是食品原料，不允许添加到乳及乳制品中，在乳中违法添加该物质，主要是为了虚增乳中蛋白质含量[1]，牟取不法利益。对食品中非法添加物的控制除了建立严格的监管机制外，快速、灵敏的现场检验方法与检验工具是遏制食品掺假、掺杂的重要手段。为此，需要建立一种方便快捷、灵敏度高的三聚氰胺检测方法，以遏制奶类食品中三聚氰胺的添加现象。
目前，常用的三聚氰胺残留检测方法是色谱分析法[2-3]，而免疫分析法[4]相对较少，市场上用于商业检测的试剂盒以国外进口产品为主，国内的产品最低检出限较高，给现场分析带来了一定的难度。为此，笔者拟采用免疫原和异源包被原进行免疫化学检验，以提高抗体与被检物质的相对亲和力，降低最低检出限，提高检验的灵敏度。本实验采用三聚氰胺的结构类似物，以6- 氨基己酸、对氨基苯甲酸为间隔臂与载体蛋白偶联制备不同的人工抗原，为三聚氰胺检验试剂盒的制备提供免疫原和包被原。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
三聚氰胺、6- 氨基已酸、对氨基苯甲酸、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸(EDC·HC1) 国药集团化学试剂有限公司；2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪(纯度97%)上海西域机电系统有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS) 美国 Sigma公司；三乙胺(化学纯) 北京益利精细化工品有限公司；氯甲酸异丁酯(纯度＞ 98%) 力得士化工北京业务部；12000～14000D 透析袋北京拜尔迪有限公司。ZAB-HS 质谱仪英国 VG公司；RE-52 旋转蒸发器德国IKA 公司； ZF-C 三用紫外分析仪、756PC 型紫外- 可见分光光度计上海雷磁新泾仪器有限责任公司；X-4 数字显示显微熔点测定仪北京泰克仪器有限公司；722S 分光光度计上海精密科学仪器有限公司；LGJ-10 冷冻干燥机北京四环科学仪器厂；ROTINA-35高速离心机德国 Hettich Gmbh 公司。
1.2 方法
1.2.1 三聚氰胺半抗原的合成
三聚氰胺的分子结构见图1A，其类似物2- 氯-4,6-二氨基-1,3,5- 三嗪分子结构见图1B，由图1A、图1B可见这两种物质结构基本相似，仅在2 位以氯取代了氨基，因此采用6- 氨基己酸和对氨基苯甲酸可以在2 位形成含有羧基的化合物如图1C、图1D 所示，以羧基与载体蛋白的氨基偶联，产生的人工抗原将具有和三聚氰胺相同的抗原决定簇。
1.2.1.1 半抗原MEA 的合成
以2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪为原料，在强碱性条件下与6 - 氨基己酸反应合成半抗原[ 5- 6]，合成路线见图2 。准确称取2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪3g(20.61mmol)和6- 氨基己酸2.7g(20.61mmol)置于250mL 圆底烧瓶中，加入150mL 蒸馏水加热搅拌溶解，待加热回流1～2h 后
再滴入2mol/L 氢氧化钠溶液30mL，继续加热回流4.5h，反应过程中采用薄层色谱(TLC)[7]监测反应进程。冷却至室温后加入1.2mol/L盐酸溶液20mL，即有大量白色沉淀出现，将沉淀过滤，置于蒸发皿中，蒸发烘干得粗产物，命名为2-(氨基己酸)-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪(MEA)，称质量为2.26g，产率为39.7%。称取粗产物1g，用三蒸水加热进行洗涤、过滤，重复3 次，干燥后得白色粉末64.91mg，产率为64.91%。合成产物用数显显微熔点仪测定熔点，以确定产物的纯度；再通过质谱分析法[8]鉴定，以确定产物的相对分子质量，从而判断合成产物是否为目标产物MEA。
1.2.1.2 半抗原MEB 的合成
以2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪为原料，在强碱性条件下与对氨基苯甲酸反应合成半抗原[5-6]， 合成路线见图3 。准确称取2- 氯-4,6- 二氨基-1,3 ,5- 三嗪600mg(4.12mmol)和对氨基苯甲酸565mg(4.12mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入80mL 蒸馏水加热搅拌溶解，待加热回流1～2h 后再滴入2mol/L 氢氧化钠溶液18mL，继续加热回流4.5h，反应过程中采用薄层色谱(TLC)[7]监测反应进程。冷却至室温后加入1.2mol/L 盐酸溶液15mL，边滴边搅拌并开始出现白色絮状混浊物，直至pH 值为5～6 时出现大量白色沉淀，将过滤所得沉淀物置于蒸发皿中，蒸发烘干得粗产物，命名为2 - ( 氨基苯甲酸)-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪(MEB)，称质量为281.4mg，产率为46.9%。称取粗产物100mg，用三蒸水加热进行洗涤、过滤，重复3 次，干燥后得白色粉末68.8mg，产率为68.8%。合成产物用数显显微熔点仪测定熔点，以确定产物的纯度；再通过质谱分析法鉴定[8]，以确定产物的相对分子质量，从而判断合成产物是否为目标产物MEB。
