三聚氰胺人工抗原的合成

1.2.1 节合成的半抗原MEA 和MEB中的活性基团羧基与生物大分子蛋白中的氨基发生缩合反应，参照文献[9-11]的方法并加以改进，将半抗原与载体蛋白偶联合成完全抗原，其中用于动物免疫的称为免疫原，用于免疫分析的称为包被原。为避免载体蛋白之间的交叉反应，免疫原与包被原需要采用不同的载体蛋白[ 12 ]，合成免疫原一般采用BSA、包被原一般采用OVA。

1.2.2.1 人工免疫原的合成

采用EDC (碳二亚胺) 法将合成的半抗原MEA 与载体蛋白BSA 相偶联，制备三聚氰胺人工免疫抗原，合成路线见图4 。准确称取24.26mg MEA 溶于 3mL 碳碳二甲基甲酰胺(DMF)中，加入38.34mg 乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)和23.02mg NHS，在室温磁力搅拌条件下反应24h。3000r/min 离心反应液10min，弃去沉淀，上清液为反应液A。另称取60mg BSA 溶于7mL、pH7.2 PBS缓冲液中，此为反应液B。将反应液B 置于磁力搅拌器上，室温条件下将反应液A 缓慢滴加到反应液B 中，4℃搅拌反应过夜。次日将反应液置于处理过的透析袋内[13]，PBS 中透析3d，除去小分子成分，进行偶联蛋白的初步纯化。偶联产物命名为MEA-BSA，透析后冷冻干燥，分装所得的固体，于－ 2 0℃保存备用。

1.2.2.2 人工包被原的合成

采用氯甲酸异丁酯法(又称混合酸酐法)将合成的半抗原MEB 与载体蛋白OVA 相偶联，制备三聚氰胺包被原，合成路线见图5 。准确称取24.26mg MEB 溶解于3mL DMF 中，室温磁力搅拌条件下加入27μL三乙胺和36μL氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应1h 以上，反应终液置冰箱冷藏温度4℃条

件下冷却1h 以上，经3000r/min 离心15min，取上清液(即活泼酯液)，此为反应液A。另称取50mg OVA 溶于7mL 碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)中，放入冰箱中预冷，此为反应液B。在室温搅拌条件下将反应液A 缓慢滴加到反应液B 中，继续搅拌反应6h 。次日将反应液置于处理过的透析袋内，4℃冰箱透析3d，每天至少换液3 次，偶联产物命名为MEB-OVA。透析后冷冻干燥，分装所得的固体，于－ 2 0 ℃保存备用。

1.2.3 人工抗原的蛋白质量浓度和偶联比测定

1.2.3.1 人工抗原的蛋白质量浓度测定

透析后的蛋白液里同时存在蛋白质、蛋白质- 蛋白质偶联物、半抗原- 蛋白质偶联物3 种物质，因此要测定该液体内蛋白的质量浓度以便估算偶联物的偶联比。考马斯亮蓝染色法[ 14 ]，具有灵敏度高，测定快速、简便、干扰物质少等优点，是测定蛋白浓度最为常用的方法，本实验将透析结束后的反应液用考马斯亮蓝染色法测定偶联物的蛋白浓度，并结合紫外扫描的图谱计算出偶联比。

1.2.3.2 人工抗原的偶联比测定

常用的人工抗原偶联比的测定方法是紫外光谱法[15]。本实验以紫外分光光度法测定OD 值，计算偶联比。将三聚氰胺半抗原、人工抗原和载体蛋白分别配成质量浓度为0.02、0.3、0.3mg/mL的溶液，在波长190～400nm处分别扫描其紫外吸收光谱，选择在波长253.5nm 处测定各光密度值，半抗原与载体蛋白偶联比计算公式如下：式中：OD 为光密度值；M 为相对分子质量；ρ为质量浓度/(mg/mL)。

2 结果与分析

2.1 半抗原的鉴定

2.1.1 熔点测定结果分析

在常压室温条件下，对MEA、MEB 两种合成产物分别进行熔点测定，采用数显显微熔点测定仪测定它们的熔点范围分别为190～195℃和131～135℃，据产品介绍，2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪的熔点为320℃，6- 氨基己酸熔点为204～207℃，对氨基苯甲酸的熔点为187～188℃，另外参与反应的其他物质为液体。由此可见，两个合成反应均有新物质生成。

2.1.2 薄层层析TLC 监测结果分析

在层析硅胶板上点样3 种物质，选择乙酸乙酯、石油醚、醋酸(体积比1:1:0.2)为展开剂，产物经薄层色谱TLC 监测，结果见图6 。从左到右第1 点为原反应物2- 氯-4,6- 二氨基-1,3,5- 三嗪，第2 点是原反应物与6- 氨基己酸反应产生的物质；第3 点是原反应物与对氨基苯甲酸反应产生的物质，多次实验出现同样结果。因为新生成物质分子质量比原反应物分子质量大，其迁移速度慢，迁移率小，所以出现上述实验结果。结果表明，在反应后生成了不同于原反应物(Rf=0.76)的新产物：第2 个点Rf=0.16、第3 个点Rf=0.15。

2.1.3 质谱鉴定结果分析

由图7 可见，最高峰值物质的相对分子质量为241.16，表明产生的新化合物相对分子质量为241.161，与目标产物的理论相对分子质量(240.26)基本一致，说明合成的新物质与目标物化合物相符，即半抗原MEA 合成成功。由图8 可见，最高峰值物质的相对分子质量为247.12，表明产生的新化合物相对分子质量为247.12，与目标产物的理论相对分子质量(246.19)基本一致，说明合成的新物质与目标化合物相符，即半抗原MEB 合成成功。

2.2 人工抗原的鉴定

半抗原与载体蛋白均具有各自的紫外吸收特征，因此其偶联物兼具有二者的紫外吸收特征，根据紫外吸光度的加和性原理，通过紫外扫描可以判断人工抗原是否偶联成功。本实验将半抗原MEA、MEB、人工抗原MEA-BSA、MEB-OVA 和载体蛋白BSA、OVA 分别配成质量浓度为0.01、0.2、0.2mg/mL的溶液，分别在220～400nm 波长处扫描，根据其紫外吸收强度，确定是否有吸收峰的叠加，结果见图9 、1 0 。由图9 可见，反应产物的吸收峰是底物MEA和BSA吸收峰的叠加，说明反应产物是MEA 和BSA 的结合物，表明偶联成功，MEA 已成为BSA 的一个特征结构即抗原决定簇，免疫原合成成功由图10 可见，反应产物的吸收峰是底物MEB 和OVA 吸收峰的叠加，说明反应产物是MEB 和OVA 的结合物，表明偶联成功，MEB 已成为OVA 的一个特征结构即抗原决定簇，包被原合成成功。

2.3 人工抗原的蛋白质量浓度和偶联比

分别根据1.2.3.1 节和1.2.3.2 节的方法测定偶联物的蛋白质量浓度并计算半抗原和载体蛋白的偶联比，结果如表1 所示。人工抗原的偶联比表示半抗原结合在载体蛋白上的数量，数量越大，所携带的抗原决定簇越多，单位质量的免疫原中所携带的抗原决定簇越多，越容易刺激机体产生特异性抗体。由表1 可见，本实验成功制备了三聚氰胺人工免疫原和人工包被原，半抗原与载体蛋白偶联比分别为25.28:1(MEA-BSA)和13.11:1(MEB-OVA)。

3 讨 论

本实验采用三聚氰胺结构类似物引入羧基，与载体蛋白的氨基偶联，产生的人工抗原具有和三聚氰胺相同的抗原决定簇。为更好地被免疫活性细胞所识别，合成的免疫原具有较长的6 个碳的连接臂(－(CH2)5COOH)，合成的包被原具有苯环结构的连接臂，这样丰富了半抗原的特征结构，达到强化抗原决定簇的目的。采用不同的半抗原偶联制备免疫原与包被原，可以有效地减少偶联位点的相似结构所产生的交叉反应，以提高抗体与被检测物质的相对亲和力，降低最低检出限，提高检验的灵敏度。