建立用荧光分光光度计测定总抗氧化能力的方法。方法：以2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)作为过氧自由基来源，sodium fluorescein(FL)为荧光指示剂，水溶性VE(trolox)为定量标准，荧光值半数衰减时间作为观察指标，测定6 种保健食品的总抗氧化能力。结果：方法的最低检测限为0.22μmol/L，线性回归方程Y=25.432X+2.0625，R2=0.9949，平行性精密度(RSD)3.5%，重复性精密度(RSD)3.9%，加标回收率在90%～104% 之间。结论：用荧光分光光度计可以测定保健食品总抗氧化能力。
关键词：食品检测；总抗氧化能力；荧光分光光度法
生物活性物质总抗氧化能力是物质清除不同自由基或物质的不同活性成分清除不同自由基的有效和，鉴于抗氧化活性物质在机体内起作用的正是其总的抗氧化能力，因此可用总抗氧化能力(total antioxidant activity，TAA)来评价生物活性物质的抗氧化功能[1-5]。氧自由基吸收能力法(oxygen radical absorbancecapacity，ORAC)是近年来由Cao 等[6-7]在Glazer[8]研究基础上发展起来的一种总抗氧化能力测定方法。它是基于H 原子转移机制(HAT)的一种方法，其与生理相关性高于基于电子转移(SET)机制的方法[9]，可以通过改变自由基和反应体系的溶剂，测定脂溶性和水溶性物质的抗氧化活性[10-14]。实验以2,2’- 偶氮二(2- 脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)作为过氧自由基来源，其与抗氧化剂的摩尔比非常高，使得方法专一性强[15-16]。方法中使用的荧光素(FL)不与待测样品发生作用，不会干扰样品的测定结果，因此对抗氧化剂测定具有特异性。
ORAC 法使用自动荧光酶标仪作为测定仪器，由于该机器价格昂贵，限制了该方法的普及。与之相比，荧光分光光度计价格低廉、应用广泛，因此有必要研究用荧光分光光度测定天然产物及保健食品总抗氧化能力的方法。
材料与方法
1.1 材料与试剂
脂益康粉、虫草粉、红曲粉、山竹粉、茄红素营养胶囊、景天养身胶囊均购于同仁堂药店。荧光素(FL)、VE 水溶性类似物(trolox) Acros 公司；2,2’- 偶氮二(2- 脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH) 美国J&K Chemica 公司；VC、环己烷、二甲亚砜、三水磷酸氢二钾、二水磷酸二氢钠(以上试剂均为分析纯) 北京化工厂；去离子水。
1.2 仪器与设备
RF-5301 PC 荧光分光光度计日本岛津公司；TDL-5-A 型台式离心机上海安亭科学仪器厂；BF211D 电子天平北京赛多利斯天平有限公司；SHB- Ⅲ型循环水式多用真空泵郑州南北仪器设备有限公司；移液器德国艾本德股份公司。
1.3 方法
1.3.1 ORAC 法原理
使用FL 为氧化底物，AAPH 为自由基产生剂。FL在有自由基作用下被氧化，荧光强度逐渐减弱；当有抗氧化剂存在时，荧光强度减弱被抑制，且抗氧化剂对FL 荧光强度的保护能力与其浓度呈正比。以抗氧化剂Trolox 作为标准，用来定量样品的抗氧化能力。
1.3.2 检测波长的选择
分别移取FL使用液0.3mL和75mmol/L磷酸盐缓冲液2.7mL，置于一洁净干燥试管中，充分混合后用荧光分光光度计扫描吸收和发射光谱图，确定最佳激发波长和发射波长。
1.3.3 AAPH 用量选择及在系统中释放过氧自由基稳定性观察用量选择：AAPH 不稳定，易受pH 值、温度等因素的影响，需要现用现配，每次开展新实验前，要重新确定其最佳用量，确定原则为FL 荧光值半数衰减时间在5～15min 为宜。AAPH 释放过氧自由基的稳定性观察：在相对恒温的环境下，用荧光半数衰减时间指标对AAPH 释放过氧自由基的稳定性进行观察。
1.3.4 标准曲线绘制及方法可靠性分析
1.3.4.1 标准曲线绘制
取Trolox 储备液(终浓度10μmol/L)加磷酸盐缓冲液依次稀释成浓度5.000、2.500、1.250、0.625、0.312、0.156μmol/L 五个Trolox 标准溶液。另设一支自由基对照(+AAPH)管、一只空白对照(-AAPH)管。各管分别加入终浓度63nmol/L FL 使用液0.3mL，标准管加入75mmol/mL磷酸盐缓冲液0.3mL，五个浓度的Trolox 0.3mL，(+AAPH)管、(-AAPH)管分别加入75mmol/mL 磷酸盐缓冲液0.6mL 和2.7mL，混匀，除(-AAPH)管外，其他各管分别加入终浓度4mmol/L AAPH 2.1mL，充分混匀，并开始计时。以荧光半数衰减时间作为纵坐标、Trolox 浓度为横坐标绘制标准曲线。荧光半数衰减时间的记录方法：以(-AAPH)管的荧光值为一个单位，当荧光值降低到0.5 个单位时所用的时间即荧光半数衰减时间。
1.3.4.2 最低检测限下限
连续测定空白(+AAPH)荧光半数衰减时间8 次，最低检测限=3s /K。式中，s 为标准偏差；K 为标准曲线斜率。
1.3.4.3 平行性精密度实验
准确称取0.01g 山竹粉5 份，分别测定总抗氧化能力并计算ORAC 值及RSD 值。具体方法如下：0.01g 山竹粉加入3mL环己烷和3mL 75mmol/L磷酸盐缓冲液，充分
