检测波长

设定激发波长为48 5nm，扫描发射波长，最大发射光谱峰在512nm(图1)。设定发射波长为512nm，扫描激发波长，最大激发光谱峰在491nm(图2)。因此，确定最佳激发、发射波长分别为491nm 和512nm。试剂用量与AAPH 在系统中释放过氧自由基稳定性观察FL 荧光值在AAPH 作用下衰减速度不宜过快。过快，样品的荧光半数衰减时间不容易拉开，灵敏度会降低。但也不宜过慢而导致实验时间增加。经反复测试，在本实验室条件下，AAPH 溶液终浓度4mmol/L 时FL 荧光衰减速度适宜。

AAPH 释放过氧自由基的速度具有一定的波动性，由图3 可知，在试剂配制4h 以后，荧光半数衰减时间出现上升趋势，说明过氧自由基释放速度有所减缓。

标准曲线及方法可靠性分析

2.3.1 Trolox 标准曲线制作

实验结果表明，荧光半数衰减时间与Trolox 浓度有良好线性关系，线性方程为Y=25.43X ＋ 2.062，线性相关系数为0.9949方法可靠性分析

2.3.2.1 最低检测下限

表1 结果表明，该方法最低检测限为0.22μmol/L。通过几种保健食品的总抗氧化能力测定，其数值在102～103μmol/g，所以此方法完全可以满足测定需要。

2.3.2.2 平行性精密度实验

表2 结果表明，方法平行性精密度为3.5%，说明该方法的平行精密度良好，测定结果较满意。

2.3.2.3 重复性精密度实验

表3 结果表明，方法重复性精密度为3.9%，说明该方法的重复性良好，测定条件易控制，测定结果较满意。

表4 结果表明，加标回收率范围为90%～104%，与荧光酶标仪测定总抗氧化能力的加标回收率相差不大[11]，回收率结果比较好，说明本测量方法的误差较小，可以作为本实验的测定方法。

2.4 测定保健品总抗氧化能力

综合考虑保健食品脂溶性部分和水溶性部分抗氧化能力，作为保健食品的总抗氧化能力。6 种保健食品均准确称取0.01g。为了保证在工作曲线内测定，用75mmol/L磷酸盐缓冲液对提取液进行不同倍数的稀释。测定结果见表5 。表5 结果表明，红曲、山竹、景天养身水溶部分抗氧化能力优于脂溶部分；蕃红素、虫草、脂益康脂溶部分抗氧化能力优于水溶部分。

3 讨 论

ORAC 法是基于HAT 机制的方法，与经典的脂质过氧化的方法类似，最接近生理真实的氧化过程。因此，ORAC 法应用在保健食品抗氧化能力检测具有重要意义，它既可以直接检测保健食品的总抗氧化能力，其中脂溶性和水溶性两部分抗氧化能力可以分别评价；也可以测定摄入保健食品前后动物血液或脏器总抗氧化能力，并根据其变化情况，进行两者相关性研究，为保健食品的研发提供重要依据。ORAC 法在我国开展的并不普遍，主要原因是受到了仪器设备的限制。本实验用荧光分光光度计替代全自动荧光酶标仪，用荧光半数衰减时间替代荧光衰退曲线下面积，建立了新的实验方法。首先确定了荧光分光光度计的最佳激发、发射波长分别为491nm 和512nm。由于ORAC 法是由FL、AAPH 和抗氧化剂(样品或标准Trolox)组成的一个三元结构的实验体系。FL 的荧光非常稳定，AAPH 产生的过氧自由基能够使FL 氧化导致荧光衰退，抗氧化剂捕捉自由基保护FL 不被氧化，同时其不与FL 反应，不会影响FL 的荧光值，因此实验标准曲线线性的好坏以及方法可靠性的关键在于AAPH 释放过氧自由基的稳定性。实验发现，AAPH 释放过氧自由基具有一定的波动性，试剂放置4h 以上，自由基释放速度有下降趋势。因此，在测定样品同时要带一个标准和空白(+AAPH)。用荧光分光光度计测定荧光衰退曲线下面积费时费力。测定一个样品需要间隔2min 测一个数据，连续测定120min。如果能用荧光半数衰减时间替代荧光衰退曲线下面积，则只需要测定2 个数据，时间约为40min。从图4 可以看到荧光半数衰减时间与Trolox 浓度有良好线性关系，线性方程为Y=25.43X+2.062，线性相关系数为0.9949。本实验在研究中用荧光衰退曲线下面积为观察指标进行测定，其与Trolox 浓度的线性方程为Y=26.03X － 0.2578，线性相关系数为0.9941。说明完全可以用荧光半数衰减时间替代荧光衰退曲线下面积作为抗氧化能力的观察指标。

标准曲线及方法可靠性分析显示：方法的最低检测限为0.22μmol/L、线性回归方程Y=25.43X+2.062，R2=0.9949、平行性精密度RSD=3.5%、重复性精密度RSD为3.9%、加标回收率在90%～104% 之间，说明用荧光分光光度计可以测定保健食品总抗氧化能力。