载体膜的制备

称取CA 0. 5 g , 溶于10 mL C1液中。放置一定时间, 防止气泡产生。加入2. 0 g HDA, 待完全溶解, 放置一定时间, 使气泡消失。边搅拌边逐滴加入同体积的C2 液。迅速将溶液倾倒于100 cm2模具中, 让其自然成膜。放入柜子中, 其上加盖滤纸。约4 h 后观察, 并适当划膜, 以防膜裂开。室温下放置7 d

载体膜的抗体包被

1. 4. 1 偶联抗体从模具中取出CA-GA-HDA 膜,修剪成规格为40 mm  40 mm 的膜片, 用三蒸水洗涤3 次( 可用100 mL/ L 的盐酸羟胺浸泡2 h) , 浸入50 mL/ L 的戊二醛溶液中, 室温反应24 h, 取出后用三蒸水清洗数次。浸入含1400 以上效价抗体的磷酸盐缓冲液( pH 8. 0, 0. 1 mol/ L) 中, 37  浸泡2h( 或4  , 24 h) , 用磷酸盐缓冲液( pH 8. 0, 0. 1mol/ L) 清洗3 次。

1. 4. 2 封闭将抗体膜用2. 5 mL/ L 的BSA 溶液37 封闭1 h( 或4  , 24 h) , 按上法清洗。将膜于

4  下保存在0. 01 mol/ L, pH 7. 0 的磷酸盐缓冲液中( 可保存半年) 。

1. 5 抗原的酶标记

称取1. 12 mg 盐酸克伦特罗、10. 00 mg( 约4 104U ) 过氧化氢酶, 溶于3 mL( 0. 05 mol/ L, pH 9. 7)碳酸盐缓冲液中, 然后加入10 mL/ L 的戊二醛100L, 在25 条件下放置30 min。用超滤法粗提取,再用Sephadex-G200 纯化, 然后用0. 05 mol/ L、pH7. 0 的PBS 洗脱, 收集纯化物备用。

1. 6  感受器部件的性能测试[ 6, 7]

1. 6. 1  质控将抗体膜固定于电极表面, 用O型圈固定此透氧膜, 电极中注入0. 5 mol/ L 的KCl作为电解液, 而后将电极插入PBS 中, 测定空白膜的电流( A) 值, 并记录4 min 内电流值的变化情况。取出电极, 在膜上加100 L 过氧化氢酶标盐酸克伦特罗( CATase-CLB) , 室温作用15 min。用0. 1 mol/ L, pH 7. 0 的PBS 液冲洗膜。将电极插入含H2O2的基质液( PBS 100 mL+ 30 mL/ L H2O2200 L) 中, 记录24 min 内电流值的情况。

1. 6. 2 测试取另一张抗体膜进行测试。?? 取出电极, 在膜上加100 L CATase-CLB 和100 LCLB 系列标准品( 0、0. 1、0 . 3、0. 9、2. 7、8. 1 g/ L) ,室温作用15 min。冲洗膜。同1. 6. 1 之, 并与上一个膜进行比较。 重复上述质控和测试过程10 次, 对检测数据进行统计。

2 结果

2. 1 感受器部件的效果和性能

感受器部件对反应体系中信号变化( H2O2的减少量) 感受效果的测定结果见表1。质控膜和测定膜的基底值差异不显著( P > 0. 05) , 而电流的净变

化值差异显著。测定值与基底值相比均降低。

2. 2  最低检测限

以不同浓度梯度的盐酸克伦特罗标准品, 即0、0. 1、0. 3、0. 9、2. 7、8 . 1 g/ L 进行测试, 结果在0. 3g/ L 时即有可感受和显示的电流出现, 所以初步确定本测定体系的最低检测限为0. 3 g/ L。

3 讨论与结论

本试验的结果表明, 质控膜和测定膜的基底值

差异不显著( P> 0. 05) , 说明膜的均一性符合标准适合进行后续的工作。而质控膜和测定膜的电流净变化值差异显著( P < 0. 05) , 测定值与基底值相比均有较大差异, 最低检测限可达0. 3 g/ L, 说明此感受器部件的灵敏度较高, 分子识别和信号的传导能力较好。由此证实, 免疫传感器的最关键环节和最难的部分研制成功, 从而为整个传感器的研制奠定了坚实的基础。